Рубцы в мозге от инсульта

Glial Scar Formation Occurs in the Human Brain after Ischemic Stroke
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3936028/

# Эти авторы внесли равный вклад в эту статью

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Реактивные глиозы и образование глиальных рубцов были подтверждены в модели ишемического инсульта у животных, но не в человеческом ишемическом мозге. Здесь мы обнаружили, что экспрессия GFAP, ED1 и хондроитинсульфат-протеогликанов (CSPG) значительно увеличилась в областях коркового обмена peri-infarct после ишемического инсульта по сравнению с соседними нормальными тканями и контрольными субъектами. Двойное иммуноблотельство показало, что GFAP-положительные реактивные астроциты в области пери-инфаркта экспрессировали CSPG, но не обнаруживали перекрытия с ED1-положительным активированным микроглии. Наши результаты показывают, что реактивный глиоз и образование глиальных шрамов, как видно на животных моделях инсульта, отражают то, что происходит в мозге человека после ишемического повреждения.

Травмы головного мозга вызывают обширный глиальный ответ, называемый реактивным глиозом, который характеризуется повышенной экспрессией специфических маркеров, таких как глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) для астроцитов, различные молекулы внеклеточного матрикса (ECM), такие как протеогликаны хондроитинсульфата (CSPG) и микроглии. В тяжелых случаях реактивный глиоз в конечном итоге приводит к образованию глиального шрама вокруг места повреждения. Глиальный ответ на ишемический инсульт широко изучался на ряде животных моделей с использованием фототромбоза и вариаций фокальной переходной или перманентной окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) 1-3. Реактивный астроглиоз, однако, является вездесущим, но плохо понимаемым признаком всех патологий центральной нервной системы (ЦНС).

Недавние исследования показывают, что реактивный глиоз оказывает как положительное, так и отрицательное воздействие на восстановление функций мозга после травмы. В острой фазе образование глиальных рубцов имеет решающее значение для герметизации участка поражения для ремоделирования ткани и временного и пространственного контроля локального иммунного ответа. Глиальный барьер изолирует область повреждения, чтобы предотвратить дальнейшие микробные инфекции и распространение клеточного повреждения, поддерживать баланс внеклеточного иона и жидкости, предотвращать подавляющие воспалительные реакции и факторы роста, а также очищать свободные радикалы 4. Кроме того, глиальный шрам стимулирует реваскуляризации кровеносных капилляров для увеличения питательной, трофической и метаболической поддержки нервной ткани. С другой стороны, глиальный шрам также действует как препятствие для регенерации аксона и, таким образом, предотвращает восстановление функции ЦНС в хронической фазе, поскольку реактивные астроциты выделяют несколько ингибирующих рост молекул, которые химически предотвращают аксональные расширения. Кроме того, компонент базальной мембраны создает дополнительный физический барьер для регенерации аксонов, который запрещает им пересекать очаг поражения. Однако эти данные основаны главным образом на мозге грызунов. Мало что известно о том, как реактивный глиоз реагирует на острый ишемический инсульт в мозге человека. В этом настоящем исследовании мы исследовали профили экспрессии компонентов глиального шрама в ишемическом мозге человека и обнаружили, что реактивный глиоз и образование глиального шрама в мозге человека после ишемического повреждения сохраняют схожие свойства с теми животными моделями инсульта.

Нормальные образцы человеческого мозга (n = 6), которые были 25-48 лет без неврологических заболеваний, были получены от мозга и тканевого банка для расстройств развития в Университете штата Мэриленд в Балтиморе (Балтимор), США. Ишемические образцы головного мозга (n = 6) были получены от пациентов с ишемическим инсультом в возрасте от 34 до 74 лет, проводивших биопсию для диагностических целей. Более подробная информация, такая как возраст, пол, продолжительность симптомов и места инфаркта, была задокументирована в нашем предыдущем исследовании. 5. Исследования проводились в соответствии с политикой и принципами, содержащимися в Федеральной политике по защите прав человека. Все образцы головного мозга были получены с информированного согласия, и это исследование было одобрено Управлением по изучению исследований в Университете Северного Техасского научного центра здоровья в Форт-Уорте, штат Техас, США.

Образцы человеческого мозга были встроены в парафин и разрезаны в 6-мкм срезах. Иммуногистохимия была проведена на этих участках, как описано выше 5. Первичные антитела использовали: 1) мышиный моноклональный анти-CSPG (Millipore, 1: 100), 2) кроличья поликлональная анти-GFAP (Sigma, 1: 1000) и 3) мышь моноклональный анти-ED1 (Serotec, 1: 200). Разделы были отображены с использованием эпифлуоресцентного микроскопа Nikon E300. Контроль включал отказ от инкубации с первичными или вторичными антителами.

Двойная метка иммуногистохимии была выполнена на участках мозга, как описано выше 5. Используемые первичные антитела были перечислены выше. В качестве вторичных антител использовали антитела Alexa Fluor 488-, 594- или 647-конъюгированные ослиные мышиные антитела против IgG (Molecular Probes, 1: 200-500). Слайды были смонтированы с использованием ProLong Gold анти-затухающего реагента с DAPI (Molecular Probes). Сигналы флуоресценции были обнаружены с использованием конфокальной сканирующей системы LSM 510 NLO, установленной на инвертированном микроскопе Axiovert 200 (Carl Zeiss Ltd) с 2-фотонным хамелеонным лазером (Coherent Inc.). Изображения были получены с помощью LSM 510 Imaging Software (Carl Zeiss Ltd). Контроль включал отказ от инкубации с первичными или вторичными антителами.

Чтобы исследовать, был ли образован глиальный шрам в ишемическом мозге у людей, мы сначала определили структуру экспрессии CSPG, основной составляющей глиального рубца 4. Как показано на рисунке 1А, CSPG в мозге 6 пациентов с инсультом был значительно выражен в кортикальные периинфарктные области (полутень) и ядро ​​инфаркта человеческого ишемического мозга по сравнению с соседней нормальной тканью.

Затем мы провели иммуноцитохимию для изучения профиля реактивных астроцитов после ишемического инсульта. Как показано на рисунке 1B, в зонах корковой области полутени наблюдалось значительное увеличение GFAP-положительных реактивных астроцитов по сравнению с соседними тканями. Большинство реактивных астроцитов в регионах проявляли гипертрофию тела клетки и процессов, которые образовывали инкапсулирующий слой вокруг места поражения. Обширные перекрытия и взаимозависимости процессов этих реактивных астроцитов были обнаружены в кортикальных областях периинфаркта в ишемических мозгах человека. В нормальной ткани наблюдалась обширная сеть тонко разветвленных процессов отдельных астроцитов без перекрытия.

Микролиоз, процесс, который видит миграцию макрофагов и местной микроглии на место повреждения в ответ на ишемическое повреждение, является формой глиоза. Следовательно, для иммуноокрашивания использовали ED1, клеточный маркер, специфичный для активированных микроглии и макрофагов. Как показано на рисунке 1C, ED1-положительная активированная микроглия была также обнаружена в лунном полушарии и сердцевине инфаркта в образцах головного мозга пациентов с инсультом.

Двойное иммуноокрашивание показывает, что белки GFAP и CSPG перекрываются в промежуточной области полутени (фиг. 2A и 2B), образуя пограничную зону между сердечником инфаркта и соседней нормальной тканью, что согласуется с экспрессией и распределением CSPG и GFAP у грызунов после ишемическая травма. ED1-положительные активированные микроглии были также распределены в области глиального рубца (рис. 2C). При более высоком увеличении GFAP-иммуноположительные реактивные астроциты проявляли морфологические особенности реактивного глиоза, включая настоящую гипертрофическую сомати и расширенные процессы в соседнем сердечнике инфаркта (рисунок 2D).

Глиальный шрам состоит преимущественно из реактивных астроцитов, микроглии и молекул внеклеточного матрикса, особенно CSPG. В этом исследовании мы обнаружили, что GFAP-положительные реактивные астроциты и ED1-положительные активированные микроглии были значительно увеличены в областях коры головного мозга в ишемическом мозге человека по сравнению с соседними нормальными тканями и контрольными субъектами. Двойное иммуноблотельство показало, что GFAP-положительные реактивные астроциты в области перистальтики экспрессировали CSPG, но не перекрывались с ED1-положительным активированным микроглии. GFAP- и ED1-позитивные клетки, наряду с CSPG, образовали тонкий слой вокруг ишемического поражения, что свидетельствует о наличии глиального рубца в коре головного мозга человека после ишемического инсульта.

Исследования показывают, что различные типы глиальных клеток активируются и образуют глиальный шрам, в котором астроциты присутствуют в значительной степени после церебральных ишемических повреждений на животных моделях. Астроциты становятся гипертрофированными, удлиняют их процессы от полутени до сердечника инфаркта после ишемического инсульта и сильно регулируют GFAP, отличительный признак астроглиоза, отвечающего на травму. Иммунореактивность GFAP в астроцитах регулируется уже через 1 день после травмы, и число реактивных астроцитов значительно увеличивается вокруг места поражения через 3-5 дней после травмы, но они отсутствуют в ядре поражения 6. Наши результаты показали, что реактивные астроциты были значительно увеличены в области пери-инфаркта, что согласуется с исследованиями на животных. Интересно, что в человеческом ишемическом мозге не было обнаружено увеличения количества реактивных клеток в соседней нормальной ткани, что отличается от животных моделей повреждения ЦНС 1. Недавнее исследование показало, что протоплазматические астроциты человека оказались более сложными и значительно больше, чем астроциты грызунов. 7. Абляция реактивных астроцитов в модели мыши показала значительное увеличение размера поражения и повреждения тканей, что указывает на полезную роль реактивного глиоза 8, 9. Глазные шрамы образуют границы вокруг участков поражения и действуют как защитные барьеры для инфекционных агентов и воспалительных клеток. Тем не менее, образование рубцов показывает менее выгодный результат в долгосрочной перспективе после оскорблений. Реактивный глиоз ингибирует аксональный рост и клеточную миграцию путем секреции CSPG и других молекул, ингибирующих нейрогенез. Основываясь на результатах грызунов, упомянутых выше, реактивный глиоз может играть двойную роль в восстановлении мозга после травм.

Реактивные микроглии / макрофаги являются вторым наиболее известным клеточным типом, присутствующим в глиальном шраме, которые наблюдаются в ишемическом ядре в течение 1-2 дней после ишемического инфаркта, и может ли их присутствие распространяться от ишемического ядра в область периинфракта время. Price et al. Изучали временные характеристики активации микроглии и обнаружили, что минимальное связывание наблюдалось в течение первых 72 часов после инсульта, но связывание индикатора значительно увеличилось в течение первой недели с некоторым снижением на 3 — 4 неделю. 10. Клетки Microglia подвергаются трансформации морфологии, высвобождая провоспалительные соединения и все чаще выражают иммуномодулирующие и пролиферирующие маркеры. Хотя роль микроглиальных клеток в развитии ишемических оскорблений еще не выяснена, растущие данные свидетельствуют о том, что помимо благоприятных эффектов провоспалительное действие микроглии может нанести ущерб поврежденному мозгу и способствовать развитию инфаркта.

CSPG представляют собой сложное семейство макромолекул, которые состоят из основного белка и одной или нескольких ковалентно прикрепленных гликозаминогликановых цепей. Реактивный глиоз включает в себя большое количество белков ECM, таких как CSPG, которые, таким образом, присутствуют в зонах реактивного глиоза после повреждения ЦНС взрослыми животными. Мы обнаружили, что CSPG был увеличен в областях коры головного мозга в мозге человека после ишемического инсульта, что указывает на то, что CSPG также является составной частью глиального шрама после ишемического инсульта у людей, как и животные модели повреждения ЦНС 11. Предыдущие исследования показали что на участке повреждения CSPG был секретирован почти всеми типами клеток, особенно астроцитами 12. Этот факт согласуется с нашими конфокальными изображениями, которые показывают GFAP-позитивные клетки, экспрессирующие CSPG, но не перекрываются с ED1, указывая, что реактивные астроциты человека также продуцировали CSPG , CSPG известны главным образом для их ингибирующих рост эффектов. Они являются мощными ингибиторами аксонов конусов роста и расширения аксонов 13. CSPGs-опосредованного ингибирование в крысиной модели травматического повреждения спинного мозга может быть преодолено с лечением хондроитиназы (Ch) ABC, которая расщепляет гликозаминогликанов цепи на CSPGs 14. Нашего недавнее исследование показало, что введение ChABC, начиная с 7 дней после очаговой ишемии, уменьшает толщину GFAP-иммунореактивного глиального шрама и улучшает нейроповеденческий исход у крыс 15.

Учитывая сложность и разнообразие человеческих глии, лучшее понимание глиальных клеток в мозге человека может облегчить будущие клинические исследования и предоставить новые способы восстановления функций мозга у пациентов с различными неврологическими заболеваниями.

Эта работа была частично поддержана грантами Национального института здравоохранения (NIH) AG21980 и NS057186 (KJ), грантами из провинциального фонда естественных наук провинции Чжэцзян (R2091137), грантами из провинции Чжэцзян по развитию талантов высокого уровня инновационного здоровья ( ZBW) и Национальный фонд естественных наук Китая (81171088). Некоторые ткани человека были получены от NICHD Brain и Tissue Bank для развития заболеваний в Университете штата Мэриленд, Балтимор, MD. Роль NICHD Brain and Tissue Bank заключается в распространении ткани и, следовательно, не может одобрить проведенные исследования или интерпретацию результатов.

Образование глиальных рубцов в области периинфракта головного мозга человека после ишемического инсульта. A. Ишемические отделы мозга человека окрашивали анти-CSPG. Представительные изображения показывают, что повышенная экспрессия CSPG была преимущественно обнаружена в области пери-инфаркта, а некоторые из них были в области инфаркта. Верхняя панель: небольшое увеличение; Нижняя панель: высокое увеличение. B. Иммуноцитохимия была выполнена с использованием анти-GFAP. Представительные изображения указывают на то, что GFAP-положительные реактивные астроциты значительно увеличились в области пери-инфаркта после ишемического инсульта у людей по сравнению с нормальной областью. Левая панель: небольшое увеличение; Правая панель: увеличенное увеличение. C. Иммуноцитохимия была выполнена с использованием анти-ED1. Представительные изображения показывают, что ED1-положительные активированные микроглии были значительно увеличены в области пери-инфаркта после ишемического инсульта у людей по сравнению с нормальной областью. Левая панель: небольшое увеличение; правая панель: высокое увеличение.

Повышенная экспрессия CSPG в реактивных астроцитах в области периинфаркта ишемического мозга человека. A. Двойная иммуноцитохимия была проведена на ишемических отделах мозга с использованием анти-GFAP (красный) и анти-CSPG (зеленый). Изображения записывались с использованием 2-фотонного конфокального микроскопа. Представительные изображения показывают, что CSPG преимущественно экспрессируется в GFAP-положительных реактивных астроцитах. B. Увеличенный вид увеличения вставки в 2A. C. Конфокальные изображения двойной метки иммуногистохимии в ишемической секции мозга с использованием анти-GFAP (красный) и анти-ED1 (зеленый). D. Более высокое увеличение показывает GFAP-положительные реактивные астроциты (красные), не ко-локализующиеся с ED1-позитивным активированным микроглии (зеленый). DAPI (синий) использовался для борьбы с ядрами.