Протеомный анализ при инсульте

    Протеомный анализ является одним из новых направлений исследований состава биологических жидкостей. Протеомика – наука, основным предметом изучения которой являются белки, их функции и взаимодействия в живых организмах, в т. ч. в человеческом. Основная ее задача – количественный анализ экспрессии белков в клетках в зависимости от их типа, состояния или влияния внешних условий [1]. Протеомика осуществляет сравнительный анализ больших групп белков – от всех белков, вовлеченных в тот или иной биологический процесс, до полного протеома (совокупности всех белков организма) [2]. Традиционно изучение белков являлось одним из разделов биохимии, но после определения структуры всей геномной ДНК человека и ряда других организмов у исследователей белков появились новые методы, с которыми и связывают появление в 1997 г. нового термина «протеомика» [3]. В частности, появились исчерпывающие базы данных, содержащие последовательности всех белков человека, а также их протеолитических ферментов, полученных в стандартных условиях. Это позволяет идентифицировать белки по молекулярной массе их фрагментов методом масс-спектрометрии. Поскольку протеомика оперирует большим объемом данных, для обработки которых требуются специализированные алгоритмы и большие вычислительные мощности, она тесно связана с биоинформатикой.
    В последние годы протеомный анализ стал неотъемлемой частью биомедицинских исследований [4]. Главной целью клинической протеомики является обнаружение нового белкового или пептидного биомаркера, который связан с определенным заболеванием. Биомаркер – молекула, наличие или отсутствие которой позволяет сделать вывод о протекании определенного клеточного процесса или определить тип клетки. Сравнение протеомов здорового человека и больного позволяет выявить конкретные белки, потенциально вовлеченные в развитие болезни, которые в дальнейшем могут стать мишенями для новых лекарственных препаратов. Кроме того, если такие белки уже известны, анализ протеома может использоваться как метод ранней диагностики.
    Одним из основных методов протеомики является масс-спектрометрия белков, которая позволяет установить количественный и качественный состав в исследуемом образце, будь то очищенный и выделенный белок или клеточный лизат. В клинической практике установление новых биомаркеров может помочь в разработке скрининговых методов для ранней диагностики заболевания.
    В настоящее время в медицине применение методов протеомного анализа позволяет выявить маркеры онкологических заболеваний на их ранней стадии [5–7]. Есть работы по диагностике хронических дерматозов и аутоиммунных заболеваний кожи методом протеомного анализа [8]. Определен протеомный профиль мочи пациентов с хроническим гломерулонефритом,  выявлены белки-маркеры, ответственные за разные фазы течения патологического процесса [9].
    В последнее время метод протеомного анализа приобретает большую актуальность и в офтальмологии. С помощью масс-спектрометрии были исследованы слеза и жидкость ПКГ, забор которых осуществлялся при различных заболеваниях [10–13], в частности, при глаукоме.
    Жидкость ПКГ (син.: водянистая влага (ВВ)) вырабатывается пигментным и непигментным эпителием цилиарного тела [14]. Секреция происходит со скоростью 2–3 мкл/мин. Человеческий глаз производит от 3 до 9 мл ВВ в сутки. Функции ВВ – обеспечение питанием бессосудистых тканей глаза (хрусталика, стекловидного тела, роговицы) и удаление шлаковых метаболитов. Основная трудность  протеомного исследования ПКГ заключается в небольшом количестве ее объема, который можно получить из одного глаза. Так как общий объем ВВ в передней камере не превышает 150–200 мкл [15] и с возрастом уменьшается [16], трудно собрать больше 100–150 мкл.
    В состав жидкости ПКГ входит около 99% воды и менее 1% белков, среди которых преобладают фракции альбуминов, глобулины и трансферрин. По сравнению с сывороткой крови ВВ содержит гораздо меньше белка (от 2,4 до 3,7  мг/мл) [17]. Также в жидкости ПКГ были обнаружены различные аминокислоты (лизин, гистидин, триптофан),  ферменты (протеаза), гиалуроновая кислота (ГК).
    Среди белков жидкости ПКГ у пациентов с глаукомой идентифицированы матриксные металлопротеиназы [18], которые осуществляют лизис базальных мембран и гидролиз всех существующих компонентов межклеточного матрикса и активируют связанные с ним ангиогенные факторы роста [19, 20]. Также в жидкости ПКГ выделены ангиогенный фактор VEGF А [21] и фибронектин [22].
    Фибронектин – гликопротеин внеклеточного матрикса, выполняет регуляторную и стабилизирующую функции в межклеточных взаимодействиях и является общей адгезивной молекулой для соединительной ткани (тканевая форма), плазмы крови и других биологических жидкостей (плазменная форма). По литературным данным, фибронектин определяется в составе псевдоэксфолиативного материала и во всех структурах дренажной системы глаза [23].
    В нескольких исследованиях обнаружена более высокая концентрация фибронектина в жидкости ПКГ у пациентов с глаукомой [24], причем при псевдоэксфолиативной глаукоме уровень этого гликопротеина значительно выше, чем при ПОУГ. Авторы связывают это с повреждением и нарушенной проницаемостью гематоофтальмического барьера [22]. В другом исследовании у пациентов без подтвержденного диагноза глаукомы с ПЭС был определен более высокий уровень фибронектина в жидкости ПКГ, чем у пациентов без ПЭС [25].
    Также в жидкости ПКГ пациентов с псевдоэксфолиативной глаукомой были обнаружены более высокие уровни металлопротеиназ 2 и 3 типа и эндогенного ингибитора металлопротеиназы-2. Это свидетельствует о нарушении баланса между металлопротеиназами и их эндогенными ингибиторами и может быть одним из звеньев патогенеза ПЭС.
    При ПОУГ в жидкости ПКГ были обнаружены более высокие уровни растворимого CD44 – интегрального клеточного гликопротеина, играющего важную роль в межклеточных взаимодействиях, клеточной адгезии и миграции. Это рецептор для ГК, некоторых других лигандов, а также, возможно, матриксных металлопротеиназ [26]. Авторы выдвинули рабочую гипотезу о том, что ПОУГ биохимически характеризуется снижением концентрации ГК в жидкости ПКГ и повышением экспрессии рецептора CD44 для ГК, что, в свою очередь, может влиять на трабекулярный аппарат и выживаемость ганглионарных клеток сетчатки.
    В нескольких исследованиях определяли уровень антител сыворотки крови пациентов с глаукомой. Были обнаружены антитела к Нsp [27], γ-енолазе [28], белку, стимулирующему активацию аденилатциклазы [29] и гликозаминогликанам [30]. Также были определены повышенные уровни антител к антигенам сетчатки и другим структурам глаза в сыворотке крови больных глаукомой [31–33]. В жидкости ПКГ пациентов с глаукомой нормального давления тоже обнаружили повышенные уровни антител к антигенам сетчатки по сравнению с таковыми у пациентов из группы контроля [34].
    Цель исследования: определить протеомный состав жидкости ПКГ и его различия при катаракте, ПОУГ и ПЭС.

    Материал и методы

    Под наблюдением находились 29 пациентов в возрасте от 45 до 82 лет. 1-ю группу (контрольную) составили пациенты с катарактой (11 человек), не имеющие другой офтальмопатологии. Во 2-ю группу вошли пациенты с катарактой и ПЭС без подтвержденного диагноза глаукомы (5 человек). 3-ю группу составили пациенты с катарактой и открытоугольной глаукомой (7 человек). В 4-ю группу вошли пациенты с катарактой, ПОУГ и ПЭС (6 человек) (табл. 1). 

    В исследование включались пациенты, не имеющие тяжелых соматических заболеваний, хронических системных заболеваний, не переносившие за последний год лазерные операции на исследуемом глазу и не имеющие в анамнезе хирургических вмешательств на глазном яблоке.
    Пациентам всех групп проводились комплексное офтальмологическое обследование и забор жидкости ПКГ для проведения протеомного исследования.
    Офтальмологическое обследование включало визометрию, периметрию, тонометрию, гониоскопию, биомикроскопию, прямую и обратную офтальмоскопию, оптическую когерентную томографию, ультразвуковое В-сканирование, пахиметрию, определение критической частоты слияния мельканий. 
    Забор жидкости ПКГ проводился во время первого этапа операции экстракции катаракты в филиале № 1 ГКБ им. С.П. Боткина «Офтальмологический стационар». Жидкость ПКГ исследовалась при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с высокоточной тандемной масс-спектрометрией. ВЭЖХ проводили с помощью прибора Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, США). Тандемный масс-спектрометрический анализ проводили с помощью прибора Orbitrap Q Exactive (Thermo Scientific, США). Лабораторные исследования проводились на базе ФГБНУ «НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича» (ИБМХ).
    В исследование были включены 29 образцов жидкости ПКГ. Каждый образец исследовался с помощью ВЭЖХ  в сочетании с высокоточной тандемной масс-спектрометрией в 3 технических повторах. Биоинформатический анализ полученных спектров проводился с использованием программы MaxQuant версии 1.5.2.8. Полученный список белков имел уровень ложноположительных результатов (FDR)=1% как для белковых, так и для пептидных идентификаций, что было получено путем сопоставления результатов с инвертированной базой данных. 
    Анализ аннотации белков жидкости ПКГ проводился с помощью Gene Ontology (GO). GO – это важный биоинформационный проект, посвященный созданию унифицированной терминологии для аннотации генов и генных продуктов всех биологических видов. Целями проекта являются поддержание и пополнение определенного списка генов и их продуктов, составление аннотаций генов и продуктов, а также разработка инструментов доступа к базе данных проекта. GO является частью более крупного проекта Open Biomedical Ontologies [35–37].
    Для определения уровня значимости обогащения использовали расчет значений p-value по формуле гипергеометрического распределения или мультивариантного гипергеометрического распределения, которое в теории вероятностей моделирует количество удачных выборок без возвращения из конечной совокупности. Наиболее значимыми считали биологические процессы с наименьшим значением p-value. Например, уровень значимости обогащения p=8,77×10-44 свидетельствует о высокой достоверности полученного результата.

    Результаты

    В работе найдены 263 белковые группы, характеризующие протеом жидкости ПКГ. Основная часть выделенных нами белковых групп отвечает за функцию связывания биологических молекул и тем самым осуществляет регуляцию клеточного ответа на различные сигналы, что важно для координации всех биохимических процессов, происходящих в жидкости ПКГ. 
    Большая часть белков (148 из 263) была обнаружена во всех группах. В соответствии с классификацией GO, большинство выделенных белковых групп участвуют в регуляции протеолиза. К примеру, ингибитор эндопептидазы и регулятор пептидазы, выделенные в жидкости ПКГ, предотвращают развитие патологического протеолиза. По литературным данным, большинство белков, обнаруженных в жидкости ПКГ, также выделены в плазме крови и спинномозговой жидкости [4].
    Из выделенных нами белков жидкости ПКГ особого внимания заслуживает Pigment Epithelium Derived Factor (PEDF, фактор пигментного эпителия, genename SERPIN F1), который относится к семейству серпинов – белков, ингибирующих пептидазы. Данный белок выявлен во всех исследуемых группах. По литературным данным, PEDF синтезируется в клетках пигментного эпителия сетчатки [38], защищает нейрональные клетки от апоптоза и является природным ингибитором ангиогенеза [39].
    Особый интерес представляют 26 белков, выделенных только в группе пациентов с катарактой. Среди них α-кристаллин (идентификатор Gene Name CRYAA), витамин K-зависимый белок (PROS1), корнеодесмосин (CDSN), плакофилин-1 (PKP1), α-цепь тубулина (TUBA1B). По литературным данным, эти белки являются структурными составляющими вещества хрусталика и появляются в жидкости ПКГ при развитии катаракты [40, 41]. Авторы связывают их появление (особенно белков-кристаллинов) с биохимическими изменениями, происходящими при  развитии катаракты. Также авторы отмечают, что гены alpha-crystallin A (CRYAA), beta-crystallin A3 (CRYBA1) и beta-crystallin A4 (CRYBA4) относятся к генам, отвечающим за изменения в хрусталике,  соответственно, мутации в них вызывают катаракту.
    Из 16 белков, характеризующих катаракту с ПЭС, впервые выявленными являются 6 белков: флавин-редуктаза (BLVRB), белок S100-A1 (S100A1), глутатион-S-трансфераза-3 (GSTM3), α-1-цепь коллагена (COL18A1), рибонуклеаза-4 (RNASE4), десмин (DES). Для группы пациентов с глаукомой найдено 12 уникальных белков, 4 из них являются впервые выявленными: аполипопротеин С-III (APOC3), α-2-цепь коллагена (COL1A2), α-3-цепь коллагена (COL9A3), пролин-богатый белок-4 (PRR4).
    Из 4 белков, характеризующих глаукому с ПЭС, 2 являются впервые выявленными: F-бокс белок (NCCRP1) и НАД(Ф)Н-дегидрогеназа (NQO1).
    Семь белковых групп, найденных на пересечении множеств «катаракта + ПЭС» и «глаукома + ПЭС», позволяют выявить тенденции к возникновению различий белкового состава при ПЭС. Основные функции этих белков – участие в связывании различных биологических молекул и регуляция метаболических процессов в жидкости ПКГ. 
    Среди белков жидкости ПКГ по сравнению со всем протеомом человека чаще встречаются аннотированные как обладающие активностью в отношении ингибирования эндопептидаз (GO:0004866) (уровень значимости обогащения p=9,74×10-41), что свидетельствует о важности защиты жидкости ПКГ от протеолиза. Основной молекулярный процесс в протеоме жидкости ПКГ – каскад активации белков (GO:0072376) (уровень значимости обогащения p=8,77×10-44), т. к. клеточный сигналинг очень важен для координации биохимических процессов в клетках. Как и ожидалось, клеточная локализация белков жидкости ПКГ аннотирована как принадлежность к внеклеточному пространству (GO:0044421) (уровень значимости обогащения p=1,78×10-196). Это обусловлено тем, что белки внеклеточного матрикса играют важную роль в формировании структур глаза, а внутренняя поверхность эндотелиальных клеток граничит с ВВ, заполняющей ПКГ.
    Анализ аннотации белков, «конститутивно» представленных в жидкости ПКГ, по результатам нашей работы и ранее опубликованным данным показал, что чаще встречаются белки, аннотированные как обладающие активностью в отношении ингибирования эндопептидаз (GO:0004866) (уровень значимости обогащения p=1,73×10-34). Преобладающим молекулярным процессом  в протеоме жидкости ПКГ является негативная регуляция пептидазной активности (GO:0010466) (уровень значимости обогащения p=4,29×10-32), важная для защиты жидкости ПКГ от протеолиза. Так, например, протеолиз субъединиц коннексинов, образующих щелевые контакты между волокнами хрусталика, или волокон, в которые упакованы кристаллины, вызывает помутнение хрусталика [42]. Клеточная локализация аннотирована как принадлежность к внеклеточному пространству (GO:0005615) (уровень значимости обогащения p=8,99×10-84).

    Заключение

    Впервые в России были исследованы образцы жидкости ПКГ 29 пациентов с катарактой, глаукомой и ПЭС  методом хромато-масс-спектрометрии на приборе высокого разрешения.
    Полученные данные позволяют оценить различия в белковом составе внутриглазной жидкости у больных  представленных групп. В исследовании были идентифицированы группы белков, ранее не описанные в составе жидкости ПКГ. Также выявлены 4 уникальные группы белков, характерные для катаракты, ПЭС и глаукомы. Найдена тенденция к возникновению различий состава протеома жидкости ПКГ у больных с ПЭС и без него.
    Анализ объединенного протеома ВВ на предмет преобладания определенных структурно-функциональных групп белков с использованием категорий GО выявил, что основной функцией белков жидкости ПКГ является ингибирование эндопептидаз.
    Обнаруженные различия в белковом составе жидкости ПКГ свидетельствуют об изменении обмена веществ, что может являться одним из ключевых звеньев  патогенеза  ПЭС и глаукомы. 
    Проведение протеомных исследований глазных жидкостей является перспективным, т. к. дает возможность разработки методов диагностики и лечения заболеваний глаза.