Полиморфизм генов при инфаркте миокарда

В.И. Коненков, И.Г. Ракова, В.Н. Максимов, М.И. Воевода

ГУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН, Новосибирск

ГУ НИИ терапии СО РАМН, Новосибирск

Изучены частоты генотипов и аллелей генов про- и противовоспалительных цитокинов у больных с перенесенным инфарктом миокарда с целью определения группы риска развития инфаркта миокарда. Полиморфизм генов цитокинов исследовали методом рестриктного анализа продуктов амплификации специфических участков генома у 118 пациентов (мужчины) в возрасте от 30 до 64 лет. Контролем служила группа из 100 здоровых мужчин в возрасте 34-64 лет. Показано, что частоты генотипов генов цитокинов и аллелей сопоставимы с частотами генотипов и аллелей генов цитокинов в западноевропейских популяциях. Обнаружена ассоциация генотипа G/G в позиции T-330G промоторной области гена IL-2 с инфарктом миокарда. Ассоциаций с генотипами и аллелями генов IL-10 промоторной области в позиции C-592 A и IL-12 в позиции А-1188 С промоторный регион при инфаркте миокарда не было обнаружено. Выявлена ассоциация генотипа C/T в позиции C-590T гена IL-4 с инфарктом миокарда. Также была проанализирована частота встречаемости аллелей промоторной зоны генов рецептора к интерлейкину-4 и выявлено, что гомозиготный вариант R/R этого гена в позиции 574 в несколько раз ниже среди больных инфарктом миокарда в сравнении с репрезентативной контрольной группой. Таким образом, изучение полиморфизмов генов цитокинов и их рецепторов может служить одним из критериев для выделения группы риска развития инфаркта миокарда

Ключевые слова: инфаркт миокарда, противоваспалительные цитокины.

Среди основных стратегий борьбы с такой медицинской и социальной проблемой, как инфаркт миокарда, справедливо рассматриваются как разработка новых высокоэффективных антиатерогенных лечебных технологий, так и разработка новых эффективных способов профилактики этого заболевания. Здесь сразу возникает вопрос о максимально раннем начале профилактических мероприятий и, следовательно, об индивидуальных критериях повышенного риска развития приводящих к инфаркту миокарда атеросклеротических изменений коронарных сосудов.

К настоящему времени установлены так называемые «традиционные факторы» риска развития атеросклероза и проведена оценка их прогностической значимости. К таким значимым факторам относятся курение, гипертензия, диабет, гиперлипедемия, мужской пол, пожилой возраст, избыточный вес [17]. При этом курение увеличивает риск возникновения коронарных событий в 1,6 раза, гипертензия (систолическое артериальное давление выше 195 мм рт. ст.) – в 3 раза, гиперхолестеринемия (8,5 ммоль/л, 330 мг/дцл и более) – в 4 раза, а сочетание трех перечисленных факторов риска – в 16 раз [13].

После выявления этих факторов риска была проведена значительная работа по исключению их воздействия на человека. Она дала ощутимые результаты, что проявилось в ощутимом снижении заболеваемости и смертности от клинических проявлений атеросклероза в виде коронарных катастроф и мозговых инсультов.

Однако у этой стратегии вскоре обнаружились и определенные недостатки, связанные, с одной стороны, с ограниченным уровнем влияния традиционных факторов риска на снижении заболеваемости, а во-вторых, с отсутствием индивидуального характера степени воздействия этих факторов на конкретного индивида.

Это стимулировало начало поиска конституциональных, генетически присущих индивиду факторов риска развития атеросклероза не на популяционном, а на индивидуальном уровне [14].

Наряду с этим проведена оценка ассоциированности развития атеросклероза с большим числом аллелей так называемых «кандидатных» генов, белковые продукты которых, согласно господствующей теории сочетанных нарушений липидного обмена и тромбообразования в развитии атеросклероза, участвуют в молекулярных событиях, приводящих к формированию атеросклеротической бляшки и к нарушению ее целостности.

Среди них идентифицированы: гены ангиотензиногена, ангиотензин-1-конвертирующего энзима, рецептора ангиотензина 2, фибриногена, аполипопротинов В, С и Е, матричных металлопротеиназ и аллели гена одного из группы регуляторных белков межклеточных взаимодействий, цитокинов, в частности интерлейкина-6 [9, 21].

Однако анализ степени информативности установленных ассоциаций выявил их невысокую прогностическую значимость, что не дает реальной возможности использовать их в качестве индивидуальных прогностических критериев предрасположенности человека к развитию атеросклероза или инфаркта миокарда [6].

В противовес этому такие цитокины с условно противовоспалительной активностью, как IL-4 и IL-10, тормозят экспрессию тканевого фактора, вызывая гипокоагуляцию и усиление секреции активатора плазминогена [22]. Кроме того, IL-4 и IL-10 подавляют действие IL-1β, IL-6 и TNFα на эндотелиальные клетки и макрофаги, являющиеся основными триггерами гиперкоагуляции.

Такие интерлейкины, как INF-γ, GM-CSF и IL-4, индуцируют способность макрофагов продуцировать активатор плазминогена, являющийся протеиназой, которая конвертирует плазминоген в плазмин. Кроме того, выявлена способность IL-1β и TNFα значительно увеличивать стимулирующий эффект тромбина и угнетать продукцию фактора Виллебранда, вызванную его агонистами [7].

Читайте также: Инфаркт миокарда и всд

Активная роль цитокинов в процессах атерогенеза и его клинических проявлений подтверждается и увеличением более чем в 2,5 раза концентрации таких цитокинов, как M-CSF, IL-6, IL-1β, в плазме у больных c нестабильной стенокардией и острым инфарктом миокарда. Одним из факторов риска развития инфаркта миокарда является повышение уровня фибриногена и С-реактивного протеина, тесно коррелирующих с уровнем TNFα, IL-1β и IL-6 [20].

Гены интерлейкинов обладают чрезвычайно высокой степенью полиморфизма, причем количество участков этого полиморфизма в одном гене может достигать нескольких десятков и располагаться они могут как в кодирующих экзонах, так и в интронах и, что особенно важно, в промоторных регуляторных зонах структуры гена. Эти участки ДНК содержат зоны связывания регуляторных факторов, которые определяют не структуру считывания, а интенсивность наработки клеткой конечного белкового продукта, т.е. самих молекул интерлейкина. [5] Другими словами, наличие аллельного полиморфизма в промоторных участках генов интерлейкинов обеспечивает разнообразие индивидов по степени продукции цитокинов при антигенной стимуляции, т.е. при формировании воспалительных клеточных реакций, в том числе и при остром инфаркте миокарда. [16]

В развитие этой концепции нами проведен анализ частоты встречаемости отдельных аллелей ряда генов интерлейкинов, расположенных именно в промоторных участках генов.

Материалы и методы

Для исследования использовалась цельная кровь 118 мужчин, перенесших инфаркт миокарда. В исследование были включены мужчины, перенесшие острый инфаркт миокарда по данным популяционного регистра инфаркта миокарда (программы ВОЗ «Регистр острого инфаркта миокарда» и «МОНИКА»). Всего было обследовано 118 мужчин, из них 93 с «определенным» инфарктом миокарда и 25 с «возможным».

Диагностические категории инфаркта миокарда определялись по протоколам указанных выше программ. Заболевание было диагностировано в возрасте от 30 до 64 лет (средний возраст 51,9 г., ст. откл. – 7,7 г.).

При эпидемиологическом исследовании по программе ВОЗ МОНИКА обследована репрезентативная выборка (100 мужчин) из неорганизованной популяции мужчин в возрасте 34-64 лет (средний возраст 52,58, ст. отклонение – 5,7 лет). Проведены опрос по анкете Роуза и антропометрия.

Для определения частот генотипов и аллелей анализируемых полиморфизмов в исследуемой популяции генотипирование было проведено на выборке жителей из открытой популяции г. Новосибирска, обследованной в рамках программы ВОЗ МОНИКА, возрастной и половой состав которой соответствовал группе обследованных пациентов.

Для генотипирования использовали образцы ДНК, выделенные из цельной венозной крови методом высаливания с использованием протеиназы К [3].

Генотипирование аллельных вариантов осуществляли методом рестриктного анализа продуктов амплификации специфических участков генома. Амплификацию осуществляли в пробирках типа «Эппендорф» путем полимеразной цепной реакции, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе [11, 12, 24].

Реакционная среда общим объемом 20 мкл состояла из буфера для проведения ПЦР («Сибэнзим», Новосибирск), включающего в себя следующие реагенты: 60 мМ Tрис-HCl (pH 8,5); 25 мМ KCl; 1,5 мМ MgCl2; 10 мМ 0,1% меркаптоэтанола; Triton X-100; а также 30 пкмолей каждого олигонуклеотида; 125 мМ каждого dNTP («Сибэнзим», Новосибирск); 50-200 нг геномной ДНК и 1-2 ед. Taq полимеразы («Сибэнзим», Новосибирск).

Программа амплификации включала стандартно предварительную денатурацию при 94 °С в течение 5 минут с последующими 30-35 циклами отжига при специфической для каждой пары праймеров температуре (1 мин), элонгации цепи при 72 °С (1 мин) и денатурации при 94 °С (1 мин). Программу завершала финальная элонгация при 72°С в течение 5 минут.

Для разделения фрагментов ДНК использовали 2%-ный агарозный гель. Продукты амплификации подвергали рестрикции соответствующими эндонуклеазами. Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле, содержащем 0,5 мг/мл этидиум бромида при напряжении 120-130 B в течение 30-45 минут и визуализировали в УФ-свете. В качестве маркера размера ДНК использовали плазмиду pUC19, расщепленную рестриктазой MspI («Сибэнзим», Новосибирск).

Источник

Тромбофилия (от греч. trhombos – сгусток и philia – склонность) – состояние системы крови, которое проявляется в нарушении гемостаза, склонности к развитию рецидивирующих сосудистых тромбозов (преимущественно венозных) различной локализации и часто возникает в

связи с беременностью, после хирургического вмешательства, травмы или физического пере-

напряжения. Заболевание обусловлено генетической (у 30–50 % с тромботическим состоянием) или приобретенной патологией клеток крови, а также дефектами свертывающей системы крови. При этом тромбофилия еще не тромбоз, но при этом наблюдается готовность организма к тромбообразованию.

Генетическая предрасположенность к тромбофилии может реализоваться через генетические дефекты как свертывающей, так и противосвертывающей (антикоагулянтной и фибринолитической) систем крови, при которых имеется готовность к тромбозу. Тромбозом называют прижизненное образование сгустков крови в просвете сосудов или в полостях сердца.

Тромбозы играют одну из главных ролей в развитии заболеваний сердечно-сосудистой системы, которые стоят на первом месте в инвалидизации и преждевременной смертности жителей экономически развитых стран. На сегодняшний день доля этих заболеваний в структуре смертности составляет 40–60 % (примерно 14 миллионов смертей ежегодно). При этом продолжающийся рост заболеваемости и поражение людей все более молодого возраста делает сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) важнейшей медико-социальной проблемой здравоохранения. Показатели смертности от ССЗ в России в 2–4 раза выше, чем в западноевропейских странах, США, Канаде, Австралии, и в настоящее время наблюдается тенденция к росту смертности. Согласно статистике последних лет, опубликованной на сайте https://www.critical.ru, в структуре смертности от ССЗ в российской популяции 85,5 % приходится на долю ИБС (46,8 %) и мозгового инсульта (38,7 %). Наследственная тромбофилия играет важную роль в структуре акушерских и гинекологических осложнений, таких как потери плода, привычное невынашивание беременности, повторные неудачи при ЭКО, тромбоэмболии у беременных.

Еще одной важной проблемой является назначение оральных контрацептивов. Оральная контрацепция является одним из самых надежных способов предотвращения нежелательной беременности, но сопряжена с риском тромбозов. Показано, что сама по себе гормональная контрацепция незначительно повышает риск тромбозов, но при носительстве определенного генотипа опасность резко возрастает. Согласно Национальным медицинским критериям приемлемости методов контрацепции 2012 года и четвертой редакции «Медицинских критериев приемлемости для использования методов контрацепции», разработанных ВОЗ в 2009 году, для предотвращения тромбозов и тромбоэмболических осложнений при приеме оральных контрацептивов рекомендовано выявление тромбогенных мутаций (F2 – протромбиновая мутация, F5 – фактор Лейдена).

Генетический анализ позволяет выявить полиморфизмы генов факторов системы гемостаза, обусловливающих их аномальный синтез или нарушение функциональной активности. Это помогает оценить риски развития сердечно-сосудистой патологии и акушерско-гинекологических осложнений, тромбоэмболии, венозных и артериальных тромбозов. Скрининг генетических особенностей тромбофилий помогает на раннем этапе выявить группу риска и внести соответствующие коррективы в тактику ведения пациентов.

Показания к назначению профиля «генетика тромбофилии»:

случаи наследственной тромбоэмболии в семье;
случаи тромбоза в анамнезе:

единичный до 50 лет;

повторные;

в любом возрасте при наличии семейного анамнеза;

необычной локализации (портальные, брыжеечные, мозговые вены);

непонятной этиологии после 50 лет;

применение гормональной контрацепции или гормональной заместительной терапии у женщин, которые имеют тромбозы в анамнезе, родственников первой степени родства с диагностированной наследственной тромбофилией или семейный анамнез тромбоэмболических осложнений
осложненный акушерский анамнез;
женщины, планирующие беременность, которые имеют тромбозы в анамнезе, родственников первой степени родства с диагностированной наследственной тромбофилией или семейный анамнез тромбоэмболических осложнений;
ситуации высокого риска:

массивные хирургические вмешательства;

длительная иммобилизация;

профилактика тромботических осложнений у больных, имеющих злокачественные новообразования.

Полиморфизм гена коагуляционного фактора II(G20210A) (протромбин)

Настоящая мутация наследуется по аутосомно-доминантному типу и в гетерозиготном состоянии встречается у 2,3 % людей в общей популяции. Клинически ее можно заподозрить по постоянно высокому уровню протромбина в плазме крови (у 87% носителей превышает 115%). Риск развития тромбоза у носителей гетерозиготной аномалии повышается в 3 – 5 раз и более значительно при использовании оральных контрацептивов.

Показания к назначению: инфаркт миокарда, гиперпротромбинемия, тромбоэмболические состояния в анамнезе, невынашивание беременности, фетоплацентарная недостаточность, внутриутробная гибель плода и задержка развития плода, отслойка плаценты, перед большими полостными операциями.