Цитокины в патогенезе инсульта

Исследование процессов, лежащих в основе острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК), является одной из интенсивно изучаемых проблем современной науки. Несмотря на заметный прогресс в понимании патогенеза ОНМК, с внедрением в практику тромболитической терапии и возникающими на ее фоне внутричерепными кровоизлияниями остается много неясного в механизмах геморрагической трансформации (ГТ) ишемического инсульта (ИИ). В случае развития симптомной ГТ как осложнения реваскуляризационной терапии, летальность составляет от 43-85% [1, 2], что объясняет актуальность исследований, посвященных данной проблеме.

Наиболее изученные предикторы ГТ ИИ стали основой официально утвержденных противопоказаний к проведению тромболизиса (проявление отека или масс-эффекта, а также обширные или большие размеры инфарктной зоны при томографическом обследовании, выраженность неврологического дефицита более 25 баллов по NIHSS; время от развития ИИ более 6 ч; гипергликемия более 22,5 ммоль/л; количество тромбоцитов менее 100 000/мм; систолическое АД более 185 мм рт.ст. или диастолическое АД более 105 мм рт.ст., одновременный прием антикоагулянтов и др.) [3, 4]. Изучены факторы риска развития ГТ в случае отсутствия применения реваскуляризационной терапии, так называемой спонтанной ГТ: кардиоэмболический подтип ИИ, повышение систолического и диастолического АД в 1-е и 2-е сутки ИИ, степень тяжести ИИ по NIHSS 15 баллов и более, постоянная форма мерцательной аритмии, транзиторные ишемические атаки в анамнезе, эпилептический приступ в дебюте ИИ [5].

В настоящее время продолжается поиск других факторов риска ГТ ИИ, обсуждается их прогностическое значение. Особое внимание уделяется роли воспаления в патогенезе ОНМК и способности нейроглии к синтезу медиаторов воспаления [6-9], из которых ведущими являются цитокины [7, 10].

Установлено, что провоспалительные цитокины вызывают и поддерживают в очаге ишемии воспалительную реакцию, что приводит к отсроченной гибели нейронов, тяжелому клиническому течению и неблагоприятному исходу заболевания. Противовоспалительные цитокины, напротив, подавляют экспрессию провоспалительных цитокинов, ограничивают воспаление и способствуют выживаемости нейронов, уменьшению зоны инфаркта, более благоприятному клиническому течению ИИ с тенденцией к восстановлению нарушенных функций [11-15]. Данные о значимости цитокинов в процессе ГТ ИИ малочисленны и противоречивы, следовательно проблема участия цитокинов в механизмах ГТ остается до конца не изученной.

Цель исследования – изучить уровни про- и противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови больных с ИИ и установить их роль в развитии ГТ.

В исследование были включены 164 пациента с ОНМК, госпитализированных в неврологическое отделение Государственной клинической больницы №1 Новосибирска.

Обследуемые пациенты были разделены на три группы: в 1-ю группу вошли 66 больных с ИИ, 34 (51,5%) женщины и 32 (48,5%) мужчины (средний возраст – 59,2±9,6 года); 2-ю группу составили 66 больных с геморрагическим инсультом (ГИ), 30 (45,5%) женщин и 36 (54,5%) мужчин (средний возраст – 56,5±7,6 года). В 3-ю группу были включены 32 пациента с ИИ с ГТ, 20 (62,5%) женщин и 12 (37,5%) мужчин (средний возраст – 59,5±7,1 года). Группу контроля составили 55 клинически здоровых доноров из отделения переливания крови. Средний возраст доноров был 54,6±1,7 года. Между группами отсутствовали различия по возрасту, полу, частоте встречаемости факторов риска (табл. 1).

Диагноз ОНМК устанавливался в соответствии с МКБ-10 на основании данных клинико-неврологического и аппаратно-инструментального обследований. Выделяли ОНМК, локализованные в бассейне средней мозговой артерии левого и правого полушарий головного мозга (ЛСМА и ПСМА), вертебрально-базилярной системе (ВБС). Патогенетический подтип ИИ устанавливали согласно критериям TOAST [16]. Для оценки выраженности неврологического дефицита использовали Скандинавскую шкалу инсульта (Scandinavian Stroke Scale, SSS) и шкалу инсульта Национального института здоровья (National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS) [17].

Критериями включения в исследование являлись: возраст больных от 18 лет и старше, госпитализация в 1-е сутки от развития ОНМК. В исследование не включали лиц с острыми воспалительными, инфекционными, нейродегенеративными, аутоиммунными заболеваниями, повторными ОНМК, черепно-мозговой травмой, острым инфарктом мио­карда, опухолевым процессом, в том числе лиц, перенесших хирургические операции и принимающих препараты иммуносупрессорного действия как минимум в течение 12 мес до забора крови.

С момента поступления все пациенты получали комплексную максимально унифицированную терапию, направленную на коррекцию нарушений дыхания и работы сердечно-сосудистой системы, борьбу с отеком мозга, улучшение перфузии мозговой ткани.

Уровень интерлейкина 1β (ИЛ-1β), фактора некроза опухоли α (ФНО-α), ИЛ-6, ИЛ-8, интерферона γ (ИФН-γ), ИЛ-1Рa, ИЛ-10, ИЛ-4 в сыворотке крови определялся методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Для этой цели использовали стандартные наборы тест-систем производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирская обл., п. Кольцово). Венозную кровь для исследования забирали утром натощак в 1-е и 2-е сутки от развития ОНМК. Образцы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин, затем отбирали сыворотку, которую немедленно замораживали и хранили при температуре –25 °С. Результаты реакции считывали с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм. Количественное содержимое цитокинов в сыворотке крови выражалось в пг/мл.

Исследование одобрено этическим комитетом больницы. До включения в исследование все участники подписали форму информированного согласия.

Статистический анализ полученных данных проводился с использованием пакета программ Statistica 6 for Windows. Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение (М±σ). Нормальность распределения в выборке проводили при помощи критериев Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса. В зависимости от типа распределения использовали параметрические (t-тест Стьюдента) и непараметрические (U-тест Манна-Уитни) критерии оценки статистической значимости различий. Сравнение несвязанных групп по качественным признакам проводилось с использованием теста &khgr;2 и точного критерия Фишера. Ассоциацию между переменными оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена (r). Значения p<0,05 были приняты как статистически достоверные.

У больных 3-й группы в 1-е и 2-е сутки показатели про- (ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-6, ИФН-γ, ИЛ-8) и противовоспалительных (ИЛ-1Ра, ИЛ-10, ИЛ-4) цитокинов сыворотки крови достоверно отличались от контрольных значений (p<0,0001) (табл. 2). Сравнение содержания цитокинов в сыворотке крови в этой группе больных между 1-ми и 2-ми сутками не выявило достоверных различий. Анализ концентрации цитокинов в 1-е сутки выявил в 3-й группе более низкие показатели ИЛ-1β – в 1,4 раза ниже контрольных значений (1,14±0,80 пг/мл против 1,68±0,21 пг/мл, p<0,0001); в 4,5 раза ниже, чем во 2-й группе (5,11±4,57 пг/мл, p<0,0001) и в 11,6 раза ниже, чем в 1-й группе (13,22±12,52 пг/мл, p<0,0001), а также более низкую концентрацию ФНО-α – в 1,7 раза ниже, чем во 2-й группе (11,10±15,31 пг/мл против 18,82±17,97 пг/мл, р=0,039) и в 5,1 раза меньше, чем в 1-й группе (56,30±61,66 пг/мл, p<0,0001). Напротив, содержание ИЛ-6 в сыворотке крови больных 3-й группы в 1-е сутки достоверно превышало в 1,4 раза таковой показатель во 2-й группе (38,99±26,50 пг/мл против 28,83±23,89 пг/мл, р=0,048) и в 1,3 раза – в 1-й группе (29,28±19,44 пг/мл, р=0,044).

При исследовании концентрации цитокинов на 2-е сутки были отмечены также достоверно низкие уровни ИЛ-1β в сыворотке крови пациентов 3-й группы – в 1,4 раза ниже контрольных значений (1,20±0,76 пг/мл против 1,68±0,21 пг/мл, p<0,0001), в 4,3 раза ниже значений ИЛ-1β во 2-й группе (5,13±5,24 пг/мл,p<0,0001) и в 11,6 раза ниже, чем в 1-й группе (13,93±13,86 пг/мл, p<0,0001). Плазменный уровень ФНО-α на 2-е сутки в 3-й группе оставался выше контрольных значений в 11 раз (14,91±21,04 пг/мл против 1,37±0,24 пг/мл, p<0,0001), но при сравнении со 2-й группой показатели ФНО-α в 3-й группе оказались в 1,5 раза ниже (21,68±24,51 пг/мл, р=0,029) и в 3,3 раза ниже относительно 1-й группы (48,71±55,41 пг/мл, р=0,001). Показатели плазменного уровня ИЛ-6 во 2-е сутки после ОНМК достоверно не различались между группами обследуемых пациентов.

Исследование содержания провоспалительного (ИФН-γ) и противовоспалительных (ИЛ-10 и ИЛ-4) цитокинов в сыворотке крови в 3-й группе выявило достоверные отличия от данных показателей 1-й группы. Различий в концентрации этих цитокинов между 2-й и 3-й группами не установлено. Так, уровень ИФН -γ в 3-й группе в 1-е сутки был в 1,4 раза ниже данного показателя в 1-й группе (23,55±11,54 пг/мл против 32,38±19,42 пг/мл, р=0,024), а во 2-е сутки – ниже в 1,7 раза (22,89±7,91 пг/мл против 39,80±31,42 пг/мл, р=0,004). Также отмечались более низкие показатели ИЛ-10 в сыворотке крови в 3-й группе по сравнению с 1-й группой: в 1-е сутки – в 1,3 раза (62,94±47,37 пг/мл против 83,74±42,79 пг/мл, р=0,038), а во 2-е сутки – в 2 раза (52,41±42,64 пг/мл против 100,1± 52,63 пг/мл, p<0,0001). Напротив, уровень ИЛ-4 в сыворотке крови больных 3-й группы в 1-е сутки превышал в 1,4 раза значения в 1-й группе (5,76±4,84 пг/мл против 4,24±1,68 пг/мл, р=0,029), ко 2-м суткам заболевания достоверной разницы по уровню ИЛ-4 между группами не отмечалось.

Показатели цитокинов ИЛ-8 и ИЛ-1Ра в сыворотке крови больных с ИИ с ГТ в 1-е и 2-е сутки достоверно не отличались при сравнении с группами пациентов с ИИ и ГИ.

Воспалительная реакция в ответ на повреждение ткани мозга (активация микроглии, миграция лейкоцитов в паренхиму мозга, высвобождение цитокинов и выработка нейротоксических факторов) является общей для различных типов ОНМК [18]. Однако при, казалось бы, однотипном нарушении функций гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) иммунный ответ организма может быть разным [6].

В настоящем исследовании впервые изучено содержание цитокинов в сыворотке крови у больных с ИИ и их участие в развитии ГТ очага ишемии. Установлено, что в 1-е и 2-е сутки заболевания у пациентов с ИИ с ГТ отмечались более низкие показатели провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ФНО-α и ИФН-γ) по сравнению с больными с ИИ и ГИ. В то же время и уровень противовоспалительного цитокина ИЛ-10 у больных с ИИ с ГТ, несмотря на превышение значений контрольной группы, был достоверно ниже показателя ИЛ-10 у пациентов с ИИ. Причины одновременного снижения в группе больных с ИИ с ГТ как про-, так и противовоспалительных цитокинов, обладающих физиологическим антагонизмом, не вполне ясны. С одной стороны, выявленный цитокиновый дисбаланс у больных с ИИ с ГТ может быть следствием острого иммунодефицитного состояния на фоне стресс-ишемии [19-21], который приводит к подавлению функции лимфоцитов и уменьшению их количества в органах периферической лимфатической системы, снижению естественной функции NK-клеток и смещению баланса Th1/Th2 в сторону преобладания Th2-цитокинового ответа [22, 23]. Описаны 2 основных механизма, которые вызывают иммуносупрессию после развития ОНМК: 1) активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы с синтезом надпочечниками глюкокортикоидов (ГКК) и 2) стимуляция симпатоадреналовой системы с высвобождением катехоламинов (КА), в результате чего ГКК и КА тормозят продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-1β, ФНО-α и ИФН-γ, кроме того, КА способны к опосредованному ИЛ-10 угнетению продукции ИЛ-1β и ФНО-α [22, 24].

С другой стороны, снижение содержания защитных противовоспалительных факторов (в данном случае ИЛ-10) у больных с ИИ с ГТ, вероятно, связано с размерами инфаркта головного мозга [15, 25], определяющими постишемические изменения системного иммунного ответа у данных больных, для которых исходно характерно наличие обширных очагов ишемического поражения ткани мозга. Полученные нами данные согласуются с результатами исследований, свидетельствующих о том, что отсутствие ИЛ-10 в сыворотке крови в 1-е сутки ОНМК, либо низкое его содержание в последующем являются показателями недостаточности иммунного ответа на острую ишемию и позволяют прогнозировать неблагоприятное течение ОНМК [26].

Более высокий уровень ИЛ-6 в дебюте ИИ с ГТ отражает выраженность эндотелиальной дисфункции и, соответственно, повышение проницаемости ГЭБ. При незначительной ишемии ГТ происходит в результате диапедеза через избыточно проницаемый ГЭБ, обычно без разрыва сосудов. Тяжелый ИИ может индуцировать избыточную преходящую проницаемость с последующим разрывом микроваскуляторного русла [3, 27, 28]. Патогенез данного явления во многом связан с повышенным синтезом провоспалительных цитокинов. Местное высвобождение эндотелиальными клетками ИЛ-6 стимулирует синтез и активацию матрикс-металлопротеиназ [29], способных вызывать деградацию внеклеточного матрикса кровеносных сосудов, что приводит к повреждению сосудистой стенки [29, 30] и, в конечном итоге, дисфункции ГЭБ в зонах нарушенной микроциркуляции, ведущей к увеличению объема очага поражения и ГТ.

Ранее отмечалась прогностическая значимость ИЛ-6 в остром периоде ОНМК: высокое его содержание коррелировало с размером инфаркта мозга [10, 31, 32], ранним неврологическим ухудшением, степенью тяжести ОНМК и его неблагоприятным течением [14, 32-36]. В настоящем исследовании наиболее высокий уровень ИЛ-6, выявленный у больных с ИИ с ГТ в сравнении с пациентами с ИИ и ГИ, может иметь важное прогностическое значение, определяющее как тяжесть течения заболевания и его исход, так и вероятность ГТ. Данное предположение подтверждается наличием (ко 2-м суткам течения ИИ с ГТ) отрицательной корреляционной связи между тяжестью ИИ с ГТ по шкале SSS и содержанием ИЛ-6 (r= –0,40; p<0,05).

Уровень противовоспалительного цитокина ИЛ-4 в 1-е сутки в группе больных с ИИ с ГТ достоверно превышал данный показатель в группе больных ИИ, однако ко 2-м суткам течения заболевания данные различия нивелировались. Имеются данные об отсутствии различий в уровне ИЛ-4-секре­тирующих моноцитов у больных с ОНМК в сравнении с контрольной группой [37], а также об отсутствии достоверной разницы по показателям ИЛ-4 у пациентов с нарастанием неврологического дефицита и без него [38]. В ходе данного исследования как в 1-е, так и 2-е сутки течения ИИ с ГТ также не было выявлено достоверной зависимости между уровнем ИЛ-4 и размером инфаркта, степенью тяжести инсульта. Однако в экспериментальной модели инсульта доказано, что введение рекомбинантного человеческого ИЛ-4 значительно сокращало объем инфаркта и снижало степень неврологического дефицита у мышей [39]. Данные результаты подтверждают ведущую роль ИЛ-4 в процессах нейровоспаления. ИЛ-4 через механизм обратной связи ограничивает синтез провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-2, ИФН-γ, ФНО-α) как клетками мозга, так и Т-лимфоцитами, активируя дифференцировку антигенстимулированных наивных Т-лимфоцитов в CD4+Th2, способных к продукции противовоспалительных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13) и подавлению генерации CD4+Th1 клеток, тем самым ИЛ-4 выполняет защитную функцию, снижая степень ишемического повреждения [39, 40]. В настоящем исследовании данные факты подтверждают выявленную прямую корреляционную связь между уровнем ИЛ-4 в 1-е сутки ИИ с ГТ и показателями ИЛ-1β (r=0,63, p<0,05), а также прямую корреляцию высокой силы между уровнями ИЛ-4 и ФНО-α (r=0,89, p<0,05), ИЛ-4 и ИФН-γ (r=0,74, p<0,05), ИЛ-4 и ИЛ-10 (r=0,85, p<0,05).

Таким образом, в ходе проведенного исследования впервые получены данные о том, что цитокинам может принадлежать важное прогностическое значение в развитии ГТ при ИИ. Изучение уровня провоспалительных (ИЛ-1β, ФНО-α, ИФН-γ и ИЛ-6) и противовоспалительных (ИЛ-10 и ИЛ-4) цитокинов в сыворотке крови в 1-е сутки ИИ может служить дополнительным прогностическим критерием в оценке течения заболевания (предиктором риска ГТ) и позволить снизить риск осложнений тромболитической терапии.